GATA-3基因多态性与LAPTM5基因功能在儿童白血病中的研究

【摘要】第一部分GATA-3SNPrs3824662与中国儿童急性淋巴细胞白血病的相关性目的：研究GATA结合蛋白3（GATA-bindingprotein-3,GATA-3）SNPrs3824662在中国儿童急性淋巴细胞白血病（Acutelymphoblasticleukemia,ALL）中的分布，分析其与中国儿童急性淋巴细胞白血病的相关性。方法：收集137例中国儿童ALL患者及389例非血液系统恶性疾病人员EDTA抗凝静脉血，提取DNA，采用巢式PCR扩增包含GATA-3SNPrs3824662位点的特异性条带后送公司测序，对其进行单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）分析。SPSS18.0分析软件对数据进行分析。结果：基因型C-C、C-A和A-A及等位基因C、A在对照和中国儿童ALL中比例没有差异，且与ALL的临床指标没有相关性。结论：GATA-3SNPrs3824662位点的多态性改变与中国儿童ALL的发病没有相关性，提示该位点与中国儿童ALL发病机制无关。第二部分儿童急性淋巴细胞白血病患者LAPTM5基因的表达及临床意义目的：溶酶体相关的五次跨膜蛋白(lysosomal-associatedproteintransmembrane5,LAPTM5)功能尚不十分明了，本研究通过定量PCR检测儿童急性淋巴细胞白血病（Acutelymphoblasticleukemia,ALL）患者骨髓标本中LAPTM5mRNA的相对表达量，回顾性的分析其表达水平与儿童ALL临床特征的相关性。方法：病例来源于2012-2013年期间在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患者144例（初诊82例、完全缓解54例、复发8例）；40例对照为同期的特发性血小板减少性紫癜（IdiopathicThrombocytopenicPurpura,ITP）或细胞株。应用定量RT-PCR方法检测LAPTM5基因的mRNA表达水平，利用SPSS18.0统计学软件，分析LAPTM5在儿童ALL中的意义。结果：初诊患儿LAPTM5mRNA的相对表达水平高于对照组，且差异有统计学意义（P<0.001）；在ALL患者中，初诊组和复发组LAPTM5mRNA的表达水平均明显高于缓解组（P<0.001，P=0.006），复发组与初诊组间没有差异（P=0.171），复发组高于对照组，差异有统计学意义（P=0.033），缓解组与对照组之间无差异（P=0.985）。初诊B-ALL中LAPTM5的表达明显高于儿童初诊T-ALL患者。LAPTM5的表达与骨髓原始细胞比例呈正相关(P=0.034,r=0.303)；与年龄、性别、初诊白细胞计数（WBC）、血红蛋白（HB）、血小板(PLT)、C反应蛋白（CRP）、乳酸脱氢酶（LDH）、外周血幼稚细胞比例没有相关性，与儿童ALL的早期治疗反应及危险度分级也没有相关性；与诱导缓解治疗33天时MRD的表达水平无相关性（P=0.695，r=-0.055）。结论：儿童初诊ALL高表达LAPTM5基因，在B-ALL中的表达高于T-ALL，与骨髓中白血病细胞数具有正相关性，但与疾病的预后指标没有相关性。第三部分溶酶体五次跨膜蛋白基因的慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达目的：构建溶酶体相关五次跨膜蛋白(lysosomal-associatedproteintransmembrane5,LAPTM5)基因的慢病毒表达载体，为研究该基因在白血病细胞中的功能奠定基础。方法：以NB4细胞的cDNA为克隆模板，通过PrimerPremier5软件设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的基因克隆引物，将LAPTM5CDS区域克隆入pLVX-IRES-Puro慢病毒表达载体。利用pLVX、pLP-VSVG、pLP1、pLP2慢病毒质粒包装系统，在293T细胞中采用磷酸钙沉淀法包装LAPTM5过表达慢病毒后侵染K562细胞，并对LAPTM5过表达慢病毒进行一系列验证。结果：经过PCR方法，有效扩增了LAPTM5基因编码区,构建了pLVX/LAPTM5慢病毒表达载体，测序分析表明所克隆的LAPTM5基因编码区序列无误。DNA水平鉴定表明LAPTM5基因已成功插入到K562细胞基因组中，且在mRNA和蛋白水平较亲本株和转空载体细胞高表达。结论：成功地构建了人LAPTM5的慢病毒表达载体pLVX/LAPTM5，为进一步研究LAPTM5在白血病细胞中的功能奠定了实验基础。第四部分LAPTM5基因对K562细胞自噬及凋亡的影响目的：LAPTM5是溶酶体的重要组成部分，溶酶体是介导自噬的重要器官，本研究通过观察过表达LAPTM5基因的K562细胞自噬及凋亡，探讨LAPTM5基因在K562细胞中的可能作用。方法：1.用HBSS代替1640完全培养基分别对转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞进行饥饿处理，于处理后0h、3h、6h收集细胞，提取蛋白后蛋白印迹检测LC3-II、LC3-I的表达，并比较其比值。2.使用携带FITC的LC3抗体标记转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞后用成像流式细胞仪检测带荧光斑点的细胞。3.使用LysoSensorGreenDND-189标记溶酶体，流式细胞仪检测转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞，根据荧光强度判断溶酶体的酸性程度。4.使用AnnexinV-FITC/PI标记转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞后，流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果：1.细胞于饥饿处理0h、3h、6h后，转LAPTM5基因的K562细胞LC3-II/LC3-I比值均低于转空载体pLVX的K562细胞。2.转空载体的K562细胞的多数量荧光斑点的细胞比率占83.1%，转LAPTM5基因细胞的多数量荧光斑点的细胞比率占57%。3.转空载体的K562细胞的荧光强度明显强于转LAPTM5基因细胞荧光强度。4.转LAPTM5基因细胞的凋亡率为33.1%，.转空载体的K562细胞凋亡率为34.2%。结论：LAPTM5基因能够抑制K562细胞的自噬而不影响其凋亡。
【作者】吴冬；
【导师】胡绍燕；
【作者基本信息】苏州大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】中国儿童ALL；GATA-3；rs3824662位点；SNP；儿童；急性淋巴细胞白血病；LAPTM5基因；定量；RT-PCR；K562细胞；自噬；凋亡；慢病毒载体；293T细胞；

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